293t細胞-英瀚斯(在線咨詢)-細胞

細胞實驗介紹——慢病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系
慢病毒包裝：公司使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，過表達慢病毒系統(tǒng)使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三質(zhì)粒系統(tǒng)，流式細胞技術(shù)，將質(zhì)?；靹蚝笫褂?鈣轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至hek293t細胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒顆粒純化*盒將慢病毒純化。純化后留取部分檢測病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。
滴度檢測：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別293t細胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況。根據(jù)細胞熒光量計算病毒滴度。
細胞：在病毒*天對細胞進行計數(shù)，接種約10000個細胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后使用無培養(yǎng)基稀釋病毒，加入12孔板中對細胞進行，病毒數(shù)量根據(jù)推薦細胞的moi加入（若無推薦moi，需做病毒梯度：1，5，10，50，100 5個梯度對細胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度。同時加入puromycin對細胞篩選，篩選約2周時間。細胞篩選好后，使用定量pcr和western blot檢測目的*的穩(wěn)定表達情況。
實驗流程：慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建-hek293t細胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t細胞-病毒收集-病毒純化-病毒滴度檢測-細胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞鑒定
結(jié)果示例：
圖 a 病毒滴度檢測；b 目的細胞病毒效果圖
軟瓊脂培養(yǎng)克l隆形成試驗基本步驟:
(1)取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活l細胞計數(shù)，用含20%胎牛血l清的dmem培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1x106細胞/l。然后根據(jù)實驗要求作梯度倍數(shù)稀釋。
(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40日中不會凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2xdmem培養(yǎng)基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，流式細胞實驗，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10ml)，293t細胞，冷卻凝固，可作底層瓊脂置co2溫箱中備用。
(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2xdmem培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2ml的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37回5%co2溫箱中培養(yǎng)10~14天。
(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞數(shù)。計算形成率。軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫l瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40日。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克l隆形成試驗。
軟瓊脂集落形成率實驗(軟瓊脂克l隆)
將1.2%低熔點瓊脂糖與2x細胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂，6孔板中每個孔1.4ml溫室凝固，取對數(shù)期細胞，胰酶消化后吹散成單個細胞懸液，計數(shù)，并調(diào)細胞濃度為10000個/ml，將0.6%低熔點瓊脂糖與2x細胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul單細胞懸液(約1000ell/wel)， 混勻，室溫凝固。置于37目，5%co2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，計數(shù)含50個細胞以上得克l隆，計算細胞集落形成率，spotll 采集圖像。
小鼠成骨細胞和*骨細胞共培養(yǎng)模型的建立
細胞之間的相互調(diào)控作用奠定基礎(chǔ).方法利用24 h內(nèi)新生小鼠顱骨和4~8周齡成年小鼠四肢長分別分離、培養(yǎng)成骨細胞和*骨細胞，細胞，采用間接接觸的培養(yǎng)模式將接種了骨sui單核細胞的玻片或骨片置入提前24 h接種了成骨細胞的培養(yǎng)皿中進行共培養(yǎng).共培養(yǎng)-定時間后進行* 骨細胞*酒石酸酸性*酶(tartrate-resistant acid phosphatase，trap染色鑒定和骨吸收功能檢測，并進一 步采用rt- pcr對*骨細胞標(biāo)志酶*基質(zhì)金屬蛋白酶.9(mmp-9)、trap 和組織蛋白酶k (cathepsin k )的表達進行檢測結(jié)果共培養(yǎng)5天后可觀trap( )多核細胞形成13天trap( )多核細胞數(shù)目達到高峰;骨吸收陷窩在共培養(yǎng)7天后開始出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，陷窩面積呈增加趨勢;*骨細胞標(biāo)志*trap在共培養(yǎng)3天時開始表達，而mmp-9和cathepsin k則在共培養(yǎng)5天后表達結(jié)論共培養(yǎng)體系中成骨細胞對*骨細胞調(diào)控作用顯著誘導(dǎo)的*骨細胞具有噬骨能力，該共培養(yǎng)模型可用于成骨細胞和*骨細胞之間的相互調(diào)控作用研究.
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