百螢 Annexin V-Cy5標(biāo)記適用于哪些儀器

一、百螢 annexin v-cy5標(biāo)記簡(jiǎn)介和工作原理
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征之一，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和一些疾病發(fā)生過(guò)程等方面起著十分重要的作用。 在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲酸（ps）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲酸（ps）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。在體內(nèi)，巨噬細(xì)胞可以識(shí)別翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面的ps 從而將這些程序性死亡的細(xì)胞，因此凋亡過(guò)程中并不伴隨局部的炎癥反應(yīng)，而在細(xì)胞壞死的過(guò)程中則常常伴隨著炎癥反應(yīng)。 annexinⅴ是一種分子量為35-36kd的ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡過(guò)程中翻轉(zhuǎn)到膜外的ps高親和力特異性結(jié)合。ps 外翻發(fā)生在細(xì)胞核破裂，dna 片段化以及凋亡相關(guān)蛋白出現(xiàn)之前，這使得annexin v 與ps 的結(jié)合成為凋亡早期的一種重要檢測(cè)標(biāo)志事件。
二、百螢 annexin v-cy5標(biāo)記實(shí)驗(yàn)方案及適用儀器分析
實(shí)驗(yàn)方案
概述
用測(cè)試化合物（200μl/樣品）制備細(xì)胞
添加annexin v結(jié)合物測(cè)定溶液
室溫孵育30-60分鐘
用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析
1.用膜聯(lián)蛋白v綴合物制備和孵育細(xì)胞：
1.1制備膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測(cè)定緩沖液：10mm hepes，140mm l和2.5mm cacl2，ph 7.4。
1.2用測(cè)試化合物處理細(xì)胞一段所需的時(shí)間（用星形孢菌素處理的jurkat細(xì)胞4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
1.3離心細(xì)胞，得到1-5×105個(gè)細(xì)胞/管。
1.4將細(xì)胞重懸于200μl膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測(cè)定緩沖液中（來(lái)自步驟1.1）。
1.5在細(xì)胞中加入2μl膜聯(lián)蛋白v結(jié)合物。
可選：在細(xì)胞內(nèi)加入死細(xì)胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細(xì)胞。
1.6在室溫下孵育30至60分鐘，避光。
1.7在用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析細(xì)胞之前，加入300μl膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）以增加體積（參見(jiàn)下面的步驟1.8）。
1.8使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度（參見(jiàn)下面的步驟2或3）。
適用儀器分析
2.使用流式細(xì)胞儀分析：
通過(guò)使用具有適當(dāng)過(guò)濾器的流式細(xì)胞儀來(lái)量化膜聯(lián)蛋白v綴合物。
注意：粘附細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白v結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測(cè)，因?yàn)樵诩?xì)胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。 然而，casiola-rosen等人先前報(bào)道了利用膜聯(lián)蛋白v對(duì)貼壁細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的方法。 和van engelend等人（見(jiàn)參考文獻(xiàn)1和2）。
3.使用熒光顯微鏡分析：
3.1移取步驟1.6的細(xì)胞懸液，用膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）沖洗1-2次，然后用膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）重懸細(xì)胞。 將細(xì)胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。
注意：對(duì)于粘附細(xì)胞，建議直接在蓋玻片上生長(zhǎng)細(xì)胞。 與膜聯(lián)蛋白v綴合物孵育（步驟1.6）后，用膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）沖洗1-2次，并將膜聯(lián)蛋白v結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）加回到蓋玻片中。 在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細(xì)胞。 在與膜聯(lián)蛋白v綴合物孵育后，細(xì)胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。
3.2在熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白v綴合物的凋亡細(xì)胞
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