Ran kit-武漢紐斯特生物技術(shù)(圖)

當(dāng)前沒有直接測定法來測量arl1 gtpases的激l活。
neweast biosciences arl1激l活檢測*盒基于特定于配置的單克l隆*l體，該*l體特異性識別arl1-gtp，但不能識別arl1-gdp。 鑒于單克l隆*l體對其*原的高度親和力，可以在短時間內(nèi)進行激l活測定。 該測定法可提供可靠的結(jié)果，并具有一致的可重復(fù)性。
arf樣蛋白1（arl1）是gtpases的ras超家族中的調(diào)控性gtpases arf家族的成員，并且在整個真核生物中都具有高度保守的直系同源*。 arl1對果蠅和秀麗隱桿線蟲的早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要。 arl1在主要序列，細胞定位和功能（膜運輸調(diào)節(jié)）上與arf1-6較相似，ran kit，甚至共享幾個共同的結(jié)合伴侶。 除了其在高爾基體/反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)中的膜運輸功能中，還有報道表明arl1在酵母中的離子穩(wěn)態(tài)中可能發(fā)揮作用。
arf6激l活測定。 經(jīng)gdp（lane1）或gtpγs（lane 2）處理后，純化的arf6蛋白被免l疫沉淀。 用*活性arf6單克l隆*l體進行免l疫沉淀。
*準備
?1x測定/裂解緩沖液：短暫混合5x儲備液，并在去離子水中稀釋至1x。 在使用前，添加蛋白酶*l劑，例如1 mm pmsf，10 μg / ml亮肽素和10 μg / ml抑肽酶。
1.將細胞（一塊10厘米長的平板，約107個細胞）培養(yǎng)至約80-90％匯合。根據(jù)需要用活化劑或*l劑刺激細胞。
2.吸出培養(yǎng)基，并用冰冷的pbs洗滌兩次。
3.完全除去pbs洗滌液，然后向細胞中加入冰冷的1x分析/裂解緩沖液（每10 cm組織培養(yǎng)板0.5-1 ml）。
4.將培養(yǎng)板放在冰上10-20分鐘。
5.用刮板將其從平板上取下。
6.將裂解物轉(zhuǎn)移至適當(dāng)大小的試管中，并置于冰上。
7.如果發(fā)生核裂解，則細胞裂解液可能變得非常粘稠，難以移液。如果發(fā)生這種情況，可將裂解液通過27?號注l射器針頭3-4次以剪切*組dna。
8.通過離心10分鐘（在4°c下為12，000 x g）清除裂解物。
9.收集上清液并將樣品（約1-2 mg的總蛋白）存儲在冰上以立即使用，或速凍并存儲在-70°c以便將來使用。
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